熒光定量PCR在反應中，引入了一種熒光化學物質(zhì)，隨著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化。從而得到一條熒光擴增曲線。熒光擴增曲線包括3個階段：基線期，擴增期和平臺期。

　　只有在熒光信號擴增期，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，所以可以在這個階段進行定量分析。為了便于對所檢測樣本進行比較，在熒光定量PCR反應的指數(shù)期，需要設定一定熒光信號的閾值，一般這個閾值是以PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本地信號，熒光閾值的缺省設置是3~15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。

　　熒光定量PCR的理論依據(jù)是什么？

　　特定的待擴增基因片段起始含量越大，則指數(shù)擴增過程越短，當擴增速率趨于穩(wěn)定后，則無論原來樣品中起始模板含量多少，擴增片段的含量通常是一樣的。理想的擴增結(jié)果：Y=X×2"其中Y代表擴增產(chǎn)物量，X代表PCR反應體中的原始模板數(shù)n為擴增次數(shù)；理論上PCR擴增效率為100%，PCR產(chǎn)物隨著循環(huán)的進行成指數(shù)增長，但實際上：DNA的每一次復制都不*，即每一次擴增中，模板不是呈2的倍增長；實際應為：Y=X（1+E）"，其中E代表擴增效率：E=參與復制的模板/總模板，通常E≤1，E在整個PCR擴增過程中不是固定不變的。通常X在1~105拷貝、循環(huán)次數(shù)n≤30時，E相對穩(wěn)定，原始模板以相對固定的指數(shù)形式增加，適合定量分析，這也就是所謂的指數(shù)期；隨著循環(huán)次數(shù)n的增加（>30次），E值逐漸減少，Y呈非固定的指數(shù)形式增加，進入平臺期。